Påvisning av resistens ved dyrkning

Fortynningsmetodene – Følsomhet hos en bakterie overfor et antimikrobielt middel kan uttrykkes som dets minste hemmende konsentrasjon («Minimal Inhibitory Concentration»; MIC) overfor stammen. Fortynningsmetoden, der bakteriestammen man vil undersøke testes mot en to-folds fortynningsrekke av antibiotikumet i buljong eller agar, er referansemetoden. MIC, angitt som mg/L, er den første konsentrasjonen der synlig vekst uteblir. I noen vanskelige kliniske situasjoner vil det også være nyttig å bestemme minste baktericide konsentrasjon (MBC).

Som for alle resistensmetodene, er standardisering avgjørende for at undersøkelsene skal gi pålitelige resultater (8). Mediet må være av høy kvalitet, blant annet ha riktig pH og saltinnhold, og gi god vekst av aktuelle isolat. Angitt inokulumtetthet, temperatur, atmosfære, inkubasjonstid, etc. må følges. Bruk av kontrollstammer vil underbygge at metoden fungerer tilfredsstillende.

Agardiffusjonsmetoden – En bakteriestammes MIC vil ha en rimelig god korrelasjon til diameteren (i mm) av hemmingssonen rundt et depot som antibiotikum diffunderer ut fra og danner en dynamisk konsentrasjonsgradient rundt. Kommersielle depoter er oftest papirlapper eller tabletter. Dette er grunnlaget for den vanligste brukte metoden for resistensbestemmelse, agardiffusjonsmetoden (8). Metoden brukes rutinemessig i de fleste klinisk-mikrobiologiske laboratorier fordi den har mange praktiske fortrinn; ved blant annet å være moderat arbeidskrevende selv når mange midler undersøkes. Standardisering og kvalitetskontroll er også her helt vesentlig.

Etest – Etest (AB Biodisk, Sverige) gir en god korrelasjon til fortynningsmetodene. Det benyttes plaststrimler som genererer en stegvis økende konsentrasjon av det antimikrobielle midlet langs strimmelen. Strimlene legges på en agarskål inokulert med en bakteriestamme på samme måte som ved agardiffusjonsmetoden, og MIC kan leses direkte fra en skala på strimmelen. Metoden er enkel: det brukes standardmedium uten antibiotika; metoden er lite avhengig av en nøyaktig bakteriekonsentrasjon og kan også brukes på mange langsomtvoksende og kravstore bakterier. Etest gir en rimelig presis MIC som kan være nyttig ved vanskelige kliniske infeksjoner, og slike målinger kan benyttes til å kartlegge små endringer i bakteriepopulasjoner for epidemiologiske formål.

Screeningmedier – En effektiv måte å påvise mikrober med en spesiell type resistens på er å undersøke vekst på et medium som inneholder én bestemt konsentrasjon av et antibiotikum. Man tar da i virkeligheten ett fortynningssteg ut av en rekke. Dette er blant annet nyttig for å påvise meticillinresistente gule stafylokokker og vankomycinresistente enterokokker. Et slikt medium kan også påvise resistente minoriteter i heterogene populasjoner; følsomme mikrober vokser ikke, men den resistente minoritet selekteres og kan eventuelt undersøkes videre (9).

Kommersielle maskiner til resistensundersøkelser bygger ofte på det samme prinsippet og påviser vekst eller ikke-vekst i noen få utvalgte antibiotikakonsentrasjoner.

Påvisning av resistensgener

I de siste årene har utviklingen i molekylær genetikk tillatt oss raskt å finne ut om resistensfaktorer er tilstede hos en bakterie uten at vekst av bakterien er nødvendig. Disse PCR-baserte metodene spiller nå en viktig rolle, særlig for bakterier som vokser sakte. For Mycobacterium tuberculosis der resultatet av resistensbestemmelse overfor rifampicin er helt nødvendig for den terapeutiske strategien, er en slik metode vesentlig (10). Påvisning av mecA-genet hos stafylokokker er nå gullstandard for å definere meticillinresistente stammer (11), mens fenotypiske metoder kan være vanskelige å tolke og er relativt langsomme.

Pneumokokker

Pneumokokkene, som bl.a. er hovedårsak til lungebetennelse, hjernehinnebetennelse og blodforgiftning hos eldre, og vanligste årsak til mellomørebetennelse hos barn, har vært stabilt følsomme lenge. I de siste vel 30 år har de begynt å utvikle resistens mot penicillin (Tabell 1). Problemet er blitt spesielt stort i flere søreuropeiske land, særlig i Spania, hvor andelen av penicillinresistente pneumokokker har nådd nesten 50 % (24). Fra Spania er resistente pneumokokk-kloner (bakterier med samme egenskaper og felles opprinnelse) blitt spredd til andre land, bl.a. Island (25). I Norge, Sverige, Danmark og Finland har problemet hittil vært lite, selv om det har økt på 1990-tallet. I 1998 er forekomsten av slike stammer fra systemiske sykdomstilfeller i Norge cirka 2 % (26).

Haemophilus

Haemophilus influenzae er viktig årsak til lungeinfeksjoner hos voksne og øvre luftveisinfeksjoner i alle aldre. Serotype B har vært en hyppig årsak til hjernehinnebetennelse og septikemi hos barn, og stammene ble i høy grad resistente mot ampicillin (betalaktamase og endringer i PBPer) fra 70-årene av. Dette problemet ble i mange industrialiserte land praktisk talt eliminert ved bruk av en nyutviklet proteinkonjugert-polysakkaridvaksine som også utrydder bæring av serotype b-organismer i halsfloraen. Mens man har fjernet et betydelig resistensproblem knyttet til alvorlig sykdom hos barn, er nå andre H. influenzae-varianter i økende grad blitt resistente mot ampicillin, slik at det mange steder i dag er 30 – 40 % av disse stammene som ikke lar seg behandle med ampicillin (27).

Tuberkelbakterier

På grunn av at denne bakterien er naturlig resistent overfor vanlige antibakterielle midler som penicillin og sulfonamider, har utvikling av medikamenter til behandling av tuberkulose vært spesielt vanskelig. Allerede i 1946 fant man at tuberkelbakterien utviklet resistens mot streptomycin, det første medikamentet som ble benyttet til behandling. Resistensutvikling skyldes mutasjoner, og hos alle pasienter, selv før antibiotikabehandling, er det alltid noen få bakterieindivider som er resistente mot hvert enkelt medikament (28). Det er derfor avgjørende at tuberkulosepasienter fra første stund behandles med flere medikamenter samtidig; for å hindre vekst av slike resistente mutanter. Siden pasienter behandles i mange måneder, er det imidlertid stor fare for at pasienter i blant ikke tar medikamentene som anbefalt. Dette kan resultere i en seleksjon av nye mutanter som er resistente mot flere medikamenter samtidig. Forekomsten av multiresistente tuberkelbasiller har i løpet av den senere tid økt dramatisk flere steder i verden. I noen utbrudd har stammen vært resistent overfor hele syv antituberkuløse medikamenter. Pasienter med slike stammer må behandles med en rekke forskjellige medikamenter som ofte gir betydelige bivirkninger, og behandlingstiden vil være minimum 18 – 24 måneder. Av og til er kirurgi eneste utvei. Det koster i dag minst 2,5 millioner kroner å behandle én enkelte pasient med multiresistent tuberkulose (29).

Streptokokker

Tendensen til resistensutvikling er meget variabel mot de forskjellige gruppene av antibiotika og mellom ulike mikrober. Selv om Streptococcus pyogenes må ha vært eksponert for seleksjonspress fra betalaktamantibiotika like mye som pneumokokker har, har utvikling mot penicillinresistens ikke vært sett ennå. Erytromycinresistens hos S. pyogenes har visst seg å være direkte relatert til nivået av erytromycinbruk i ulike populasjoner (30). Hos orale streptokokker (viridansgruppen), er imidlertid penicillinresistens også blitt ganske vanlig, spesielt hos Streptococcus mitis og Streptococcus sanguis. I likhet med pneumokokker, er resistens hos disse artene forårsaket av forandringer i PBPer. Makrolidresistens hos orale streptokokker er også rapportert etter behandling av periodontitt med makrolider (31).

Anaerober

Resistensbestemmelse av anaerober blir relativt sjelden gjennomført på grunn av at undersøkelsen er vanskelig og ofte, pga. forutsigbar følsomhet, har hatt liten betydning for terapi. Metronidazol, klindamycin, kloramfenikol og karbapenemer har stort sett vært effektive mot de fleste anaerobe bakterier (32), mens tetracyklinresistens økte allerede i Bacteroides fragilis-gruppen på 1970-tallet (33). Penicillin var lenge ansett som førstevalg mot anaerobe infeksjoner over mellomgulvet; orale anaerobe arter har imidlertid utviklet resistens mot penicillin og ampicillin på grunn av betalaktamase, med rapporterte tilfeller av behandlingsvikt (34). Cirka 50 % av Prevotella spp. er nå resistente mot penicillin og ampicillin, også som følge av betalaktamaseproduksjon (35). Piperacillinresistens har økt fra 10 till 30 % i løpet av de siste årene. Klindamycin er et av de viktigste antianaerobe midlene; klindamycinresistens, ofte sammen med tetracylinresistens, har økt betydlig i 90-årene (36). Til og med metronidazolresistens ser nå ut til å øke (37). Tabell 3 viser, som eksempel, forekomsten av resistens hos kliniske isolater av anaerobe bakterier isolert i USA i 1998 – 99 (36).