Resistensbestemmelse

Alt for flere år siden var det noen laboratorier som hadde utviklet metoder til resistensbestemmelse av gjærsopp. Metodene var imidlertid ikke standardiserte og undersøkelser viste at det kunne være svært store variasjoner i resultatene når man sammenlignet ulike metoder (6). Resistensbestemmelse av gjærsopp er vanskelig fordi en rekke ulike faktorer kan influere på resultatet. Dette gjelder f.eks. valg av medium, tillaging av inokulat, inokulatets tetthet, inkubasjonstid, inkubasjonstemperatur og valg av kriterium for avlesning av endepunkt (7).

I de senere år har det vært utført et betydelig arbeid i regi av National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) i USA for å komme frem til en standardisert referansemetode, slik at man kan sammenligne resultater oppnådd i ulike laboratorier. En buljongfortynningsmetode som enten kan utføres i rør eller i mikrotiterbrett ble relativt nylig godkjent som referansemetode (8). Med denne metoden lager man først en 2-fold fortynningsrekke av antimykotika i rør eller brønner i et mikrotiterbrett. Deretter inokuleres rørene (brønnene) med et standardisert gjærsopp- inokulat. Etter inkubasjon i 24 eller 48 timer finner man den minste konsentrasjonen av antimykotika som hemmer vekst av gjærsopp. Verdien for minste hemmende konsentrasjon (MIC) er uttrykk for soppstammens følsomhet for vedkommende medikament.

Resultatet av resistensbestemmelse med NCCLS-metoden kan imidlertid være vanskelig å avlese for noen medikamenter. Azoler kan ofte gi en gradvis hemming av soppens vekst over flere antimykotikakonsentrasjoner. Det er derfor nødvendig med relativt lang erfaring for å kunne bestemme MIC-verdien for enkelte Candida-stammer på en standardisert måte. I tillegg er NCCLS-metoden relativt arbeidskrevende. Den er derfor lite egnet for bruk i mindre laboratorier og det har følgelig vært arbeidet med å utvikle enklere metoder. Eksempler på dette er Etest (AB Biodisk, Sverige) og agardiffusjonsmetoden. Med Etest benyttes en plaststrimmel som inneholder en ferdiglaget fortynningsrekke av antimykotika. Denne legges på en agarskål inokulert med en gjærsoppstamme. Etter inkubasjon kan MIC avleses direkte fra en skala trykket på plaststrimmelen (Fig. 1). Med agardiffusjonsmetoden benyttes en tablett (eller filterpapirlapp) med et depot av antimykotikum. Tabletten legges på en agarskål inokulert med en gjærsoppstamme. Etter inkubasjon vil man få en sone rundt tabletten der gjærsoppstammen ikke vokser. Størrelsen på hemningssonen vil være et uttrykk for stammens følsomhet for medikamentet i tabletten (Fig. 2).

En rekke sammenlignende undersøkelser mellom NCCLS-metoden og Etest-metoden har vært utført. De fleste av disse studiene konkluderer med at Etest er et pålitelig alternativ til referansemetoden (9), men det er også noen undersøkelser som har vist en del avvik ved resistensbestemmelse overfor azoler (10). Ulempen med Etest er at den er relativt kostbar.

De aller fleste mikrobiologiske laboratorier i Skandinavia benytter allerede en agardiffusjonsmetode til resistensbestemmelse av bakterier og kjenner derfor denne metoden godt. Det ville derfor være en fordel dersom denne metoden også kunne benyttes til resistensbestemmelse av sopp. En slik test ble da også utviklet for nærmere 25 år siden og ser ut til å være i bruk i flere land i Europa (11, 12). Metoden har først og fremst vært evaluert for resistensbestemmelse overfor flukonazol (13 – 16). Undersøkelser, blant annet fra Norge, har vist at den er en god screeningundersøkelse for gjærsopp med nedsatt følsomhet (15, 16). Det er imidlertid et problem at man ikke kan skille mellom helt resistente stammer (MIC = 64 mg/ml) og stammer med moderat nedsatt følsomhet (MIC 16 – 32 mg/ml). I tillegg kan noen følsomme stammer bli angitt som resistente. Det er derfor nødvendig at stammer som har nedsatt følsomhet med agardiffusjonsmetoden undersøkes på nytt med en MIC-metode (16).

Klinisk korrelasjon

Resistensbestemmelse in vitro har klinisk nytteverdi bare hvis det er en sammenheng mellom resultatet av resistensbestemmelsen og behandlingsresultat in vivo. Imidlertid er det en rekke faktorer i tillegg til gjærsoppens in vitro-følsomhet som har stor betydning for behandlingsutfallet. Eksempler på dette er pasientens immunforsvar, underliggende sykdom, farmakokinetikk, medikamentinteraksjoner, den øvrige pasientbehandlingen osv. Det er derfor på ingen måte sikkert at antimykotisk behandling av en alvorlig infeksjon forårsaket av en soppstamme med lav MIC-verdi (en in vitro-følsom stamme) vil være vellykket. Dersom en pasient har en infeksjon forårsaket av en in vitro-resistent stamme bør imidlertid sjansen for behandlingssvikt være stor dersom medikamentet benyttes.

Fordi det nå er utviklet en referansemetode for resistensbestemmelse, har det også vært mulig å sammenholde resultatet av en rekke kliniske studier med siktemål å evaluere korrelasjon mellom resistensundersøkelse in vitro og behandlingsresultat in vivo. De fleste av disse undersøkelsene gjelder flukonazol og itrakonazol og oftest hos aids-pasienter med candidaøsofagitt eller ikke- nøytropene pasienter med fungemi. På grunnlag av slike studier har NCCLS nå kommet med forslag til MIC brytningspunkter for disse to medikamentene (Tabell 1) (17). Når det gjelder amfotericin B, foreligger det langt færre undersøkelser. Årsaken til dette er trolig at resistens forekommer sjelden, men det kan også se ut til at NCCLS-buljongfortynningsmetoden er mindre egnet til resistensbestemmelse overfor dette medikamentet (18).

Resistensforhold

Det er i dag to medikamenter, amfotericin B og flukonazol, som anbefales til behandling av alvorlige soppinfeksjoner (19). I tillegg kan flucytosin i visse situasjoner anvendes sammen med amfotericin B.

Amfotericin B har vært det viktigste medikamentet til behandling av alvorlige soppinfeksjoner i over 40 år. Forbruket i Norge er imidlertid lavt. Grunnen til dette er ganske sikkert at medikamentet ofte kan forårsake alvorlige bivirkninger og derfor kun benyttes på strenge indikasjoner. Resistens overfor amfotericin B har svært sjelden vært rapportert. Noe av årsaken til dette kan imidlertid være metodologiske problemer forbundet med resistensbestemmelse overfor amfotericin B (18). I en nylig publisert oversiktsartikkel over amfotericin B-resistens (20) ble det kun referert til 26 publikasjoner med i alt 44 pasienter. Resistensutvikling ser derfor ikke ut til å være et problem av betydning. Man regner med at de aller fleste gjærsopparter, med unntak av noen få og sjelden forekommende species, er følsomme overfor amfotericin B.

Flucytosin benyttes lite til behandling av alvorlige soppinfeksjoner. Resistens overfor dette medikamentet kan utvikles raskt og flucytosin skal derfor alltid gis i kombinasjon med et annet medikament (amfotericin B). Av 506 Candida blodkulturisolat fra Norge i perioden 1991 – 1996 hadde 27 (5 %) stammer nedsatt følsomhet (MIC = 8 g/ml) for flucytosin (Tabell 2). I en undersøkelse fra Sverige har man funnet liknende resultat. Av 232 blodkulturisolat fra 15 svenske sykehus i perioden 1994 – 1998 hadde 11 (5 %) stammer nedsatt flucytosin-følsomhet (21).

Flukonazol har lite bivirkninger og har vist seg likeverdig med amfotericin B til behandling av infeksjoner forårsaket av følsomme stammer hos ikke-neutropene pasienter (22). Preparatet benyttes derfor mye både til behandling av lokale og invasive gjærsoppinfeksjoner. De aller fleste gjærsopparter er følsomme overfor flukonazol, men det er imidlertid noen viktige unntak. Alle isolat som tilhører artene Candida krusei og Candida norvegensis vil for eksempel være resistente uansett tidligere eksponering for medikamentet. I tillegg har en stor andel av en tredje Candida-art, Candida glabrata, nedsatt følsomhet overfor flukonazol med MIC-verdier over 4 – 8 mg/ml (23, 24). Infeksjoner forårsaket av slike stammer vil være vanskelig å behandle med vanlige doser (17).

Den hyppigst forekommende Candida-arten, Candida albicans, er følsom for flukonazol, men denne arten kan imidlertid utvikle resistens som et resultat av genetiske mutasjoner (26). Resistensutvikling overfor azoler ble beskrevet allerede på begynnelsen av 1980-årene. Antall rapporter var imidlertid svært få og gjaldt stort sett pasienter med mukokutan candidiasis som hadde vært behandlet med mikonazol eller ketokonazol over lang tid (27). I de fleste land ble flukonazol registrert til bruk på begynnelsen av 1990-årene. Dette sammenfalt med et økende antall pasienter med aids med behandlingstrengende oral candidiasis og candidaøsofagitt. Disse pasientene ble ofte gitt flukonazoltabletter til selvbehandling over kortere eller lengre tid for å kurere symptomgivende infeksjoner i hals- og spiserør. Infeksjonen var residiverende og mange pasienter hadde derfor et relativt stort flukonazolforbruk. Det tok ikke lang tid før det kom rapporter om resistensutvikling overfor flukonazol hos C. albicans-isolat (15,28,29). De fleste av disse pasientene hadde benyttet medikamentet over lang tid. Det har etter hvert blitt utført mye arbeid for å avklare de genetiske mekanismene som fører til resistens overfor azoler (26). Flere ulike mekanismer er beskrevet. Noen av disse vil forårsake resistens overfor et enkelt azol, mens andre vil forårsake kryssresistens overfor flere medikamenter. Azolresistens kan utvikles gradvis over tid og ulike kombinasjoner av resistensmekanismer kan være tilstede i et klinisk isolat (26,30).

Hos aids-pasienter har utvikling av flukonazolresistente C. albicans-stammer vært et problem. Foreløpig ser det imidlertid ut til at det er en svært lav forekomst av resistente C. albicans-stammer hos andre pasientgrupper (Tabell 2). Årsaken til dette er trolig at de fleste pasienter behandles over kort tid slik at resistensutvikling ikke finner sted.

Undersøkelser av Candida-arter isolert fra blodkultur i Danmark, Norge og Sverige har bekreftet at den hyppigst forekommende arten, C. albicans, i regelen er følsom for fluconazol, mens C. glabrata oftest har nedsatt følsomhet (Tabell 3) (21, 24, 31).

Det har også vært bekymring for at økt flukonazolbruk skal føre til et seleksjonspress med økt forekomst av non-albicans-arter med nedsatt følsomhet. Endringer kan sikkert forekomme i sykehus der flukonazol brukes mye til profylakse og behandling (32). Det er imidlertid mange faktorer som kan ha betydning for hvilke Candida-arter som dominerer på hvert enkelt sykehus. Det kan blant annen være betydelige forskjeller fra land til land når det gjelder forekomst av ulike gjærsopparter. I USA er f. eks. C. albicans-andelen av isolat fra blodkultur omkring 50 %, mens man i Norge og Finland finner at ca. 65 – 70 % av candidemi-isolatene utgjøres av C. albicans (24, 25). I USA ser det ut til at det har skjedd en endring i fordelingen av non-albicans-artene isolert fra blod i og med at forekomsten av Candida tropicalis har gått ned og C. glabrata har økt de senere år (4). I en studie fra fem universitetssykehus i Nederland fant man også en økning av C. glabrata-forekomsten fra 6,8 % i 1987 til 14,8 % i 1995 (33). Årsaken til slike endringer er ikke klarlagt. Ved andre sykehus har speciesfordeling vært uendret gjennom lang tid. På Rigshospitalet i København var det for eksempel ingen forskjell i fordeling av Candida-species isolert fra blodkultur fra 1984 til 1994 (33). Speciesfordelingen var også omtrent den samme i norske sykehus i perioden 1991 til 1999 (34). Forekomsten av C. glabrata i Norge har vært forholdsvis høy (13 – 14 %) både før og etter at flukonazol ble introdusert på markedet.

Fordi antall medikamenter til behandling av alvorlige mykoser er svært begrenset, vil en økning i resistens kunne få alvorlige konsekvenser. Det er derfor viktig at resistenssituasjonen i Skandinavia overvåkes for å oppdage eventuelle endringer. Dersom resistens skulle bli et problem, vil det være viktig å endre behandlingsrutiner for om mulig å snu en slik utvikling.

I Norge har man fra 1991 systematisk overvåket resistensforholdene for gjærsopp isolert fra blodkultur og andre viktige isolat. Alle de mikrobiologiske laboratoriene i landet sender slike isolat til identifisering og resistensbestemmelse ved mykologisk laboratorium på Statens institutt for folkehelse. De viktigste resultat av denne overvåkningen er gjengitt i Tabell 2.

Konklusjon

1. Utvikling av resistens mot antimykotika har foreløpig vært et lite problem når det gjelder gjærsopp. Dersom nye azoler gis over lang tid, kan det oppstå genetiske mutasjoner som fører til resistens. Det er også en fare for at et økt totalforbruk av azoler kan føre til en seleksjon av azolresistente species.

2. Fordi antall medikamenter til behandling av alvorlige mykoser er svært begrenset, vil en økning i resistens kunne få alvorlige konsekvenser. Det er derfor viktig at resistenssituasjonen i Skandinavia overvåkes for å oppdage eventuelle endringer.

3. De fleste gjærsopparter har foreløpig et forutsigbart resistensmønster overfor de viktigste antimykotika (Tabell 2 og 3). En identifikasjon til speciesnivå vil derfor gi et godt holdepunkt for valg av medikament.

4. Fordi soppbehandling ofte startes på empirisk grunnlag vil en samlet oversikt over hvilke arter som vanligvis forårsaker alvorlige soppinfeksjoner på et sykehus være nyttig ved valg av medikament.