Karies och Streptococcus mutans

S. mutans är den bakterie som primärt orsakar karies (7). Nyckeln till att förstå S. mutans kolonisation av munhålan är kunskapen om hur olika molekylära komponenter på bakteriens cellyta interagerar med salivpellickeln på tanden. Baserat på likheter i DNA delas mutansstreptokocker upp i sju olika arter. Varje art kan i sin tur delas upp i åtta olika serotyper. Genomet hos S. mutans har nyligen sekvenserats och visar sig bestå av 2 030 936 baspar (8). Det är kunskapen om genomets uppbyggnad och analyser utifrån detta som i framtiden kan ge forskarna värdefull insikt om hur S. mutans har anpassat sig för att överleva i den orala miljön.

S. mutans har på sin cellyta ett antal olika ytbundna strukturer (till exempel serotyp specifika polysackarider, glucosyltransferaser Gtfs), glukanbindande proteiner (GBP) och ytadhesionsprotein SAI/II (surface adhesion I/II också kallat Ag I/II, antigen I/II) (9, 10). Cellytemolekylerna spelar en viktig roll i bakteriens interaktioner med sin värdorganism och har blivit mycket uppmärksammade som potentiella vaccinkandidater. Dessa virulensfaktorer är starkt involverade i S. mutans’ förmåga att binda till salivpellickeln (tandytan) och överleva under perioder av svält och syrafall.

Surface adhesion molecule SAI/II är ett cellytebundet adhesin som är involverat i den initiala bindningen, vidhäftningen, av S. mutans till salivagglutininreceptorn i salivpellickeln (den receptor i salivpellickeln som har förmåga att sammanklumpa bakterierna) och anses spela en betydande roll vid kolonisationen av S. mutans i munhålan (11). (Detta protein har även kallats AgI/II, B, IF, P1, SR, MSL-1 och PAc (9).) SAI/II har länge ansetts som ett av S. mutans viktigaste antigen och är en betydande virulensfaktor. Ett stort antal av de studier om aktiv och passiv immunisering mot karies som hittills har publicerats har handlat om antikroppar som riktas mot detta protein.

Ytterligare en viktig virulensfaktor med stor betydelse för S. mutans’ förmåga att kolonisera är glukosyltransferaserna; ett cellytebundet enzym, eller snarare enzymgrupp, som ansvarar för produktionen av glukan. Glukan är en extracellulär polysackarid som syntetiseras av S. mutans från glukos. Mutans-streptokockerna använder glukan som energikälla vid svält och som ett sammanhållande «klister» på den glatta tandytan (12). Glukan finns i saliv och införlivas i den initiala salivpellickeln på tandytan. Väl på plats kan den verka för selektiv vidhäftning av mutanstreptokocker och spela en viktig roll vid bildandet av plack (13). Sammanfattningsvis är glukosyltransferaserna en mycket viktig virulensfaktor för S. mutans’ möjlighet att överleva och kolonisera tandytan.

Karies och laktobaciller

Laktobaciller är en grupp grampositiva bakterier som använts för konservering och jäsning av mat i århundranden. Vissa stammar är naturliga delar i mag-tarmkanalens normalflora (14). Laktobaciller klassas som så kallade GRAS-organismer (Generally regarded as safe) och är inte sjukdomsframkallande. I dag kan man till exempel hitta dem i så kallad functional foods (exempelvis yoghurt). Ett flertal forskare anser att de kan förebygga infektioner som till exempel diarré och inflammatoriska tarmsjukdomar (15).

I munhålan har laktobaciller länge ansetts ha samband med karies på grund av att de upptäckts i kariöst dentin och att de producerar mjölksyra som kan påskynda kariesprocessen. I en nyligen utförd studie noterade man att laktobaciller som togs från kariesfria respektive kariesaktiva patienter skiljde sig märkbart. Laktobaciller från kariesaktiva patienter fäste lättare vid fuktiga ytor och hade en lägre produktion av ämnen som har en hämmande effekt på andra mikroorganismers tillväxt (16). På odlingsplatta kan S. mutans inte växa i närvaro av Lactobacillus paracasei (L. paracasei) utan det bildas en klar zon runt laktobacillerna (Fig. 1) (17). Man har med intresse noterat att Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) har förmåga att producera substanser med hög aktivitetshämmande effekt mot ett antal bakterier (inklusive Streptococcus spp) (18). Både laktobaciller och LGG anses konkurrera med streptokocker om så kallade orala adhesionssites. In vitro har man visat att LGG kan kolonisera munhålan tillfälligt och därmed minska tillväxten av S. sobrinus (19). Laktobaciller som isoleras från människa kan även hämma produktionen av glukan från S. mutans (20). I en finsk studie fick barn på daghem mjölk som innehöll LGG i sju månader. Resultaten visade att de barn som fått LGG hade lägre kariesutveckling och färre antal S. mutans i slutet av studien (21).

Sammanfattningsvis är laktobaciller en stor och heterogen grupp bakterier som bör omvärderas även ur kariologisk synvinkel. Det har visat sig att laktobaciller skulle kunna användas som probiotika mot karies och i framtiden även andra sjukdomar i munhålan. När det gäller karies är det viktigt att använda en stam som producerar lägre mängd syra för att undvika progression av karies. Deras förmåga att producera bakteriehämmande substanser (så kallade bakteriociner) är ett mycket intressant forskningsfält och det faktum att de kan kolonisera munhålan gör dem till perfekta bärare av vaccin.

Bovina antikroppar

Bovina antikroppar, antikroppar från ko, passerar via en aktiv transport från plasman till mjölken hos kor och finns i höga koncentrationer i djurens råmjölk (kolostrum) (3). Kons råmjölk kan innehålla 40 – 200 mg antikroppar/ml och har använts vid passiv immunisering mot ett antal patogener i mag-tarmkanalen (inklusive S. mutans). När kon immuniserats med antigen, väntar man in immunsvaret. Djuret kan sedan mjölkas på råmjölken som nu är rik på antikroppar. De första 5 – 6 mjölkningarna ger störst mängd antikroppar. Metoden kan upprepas flera gånger på samma ko, men processen att rena fram antikroppar är fortfarande mycket arbetskrävande och kostsam.

Michalek et al. visade i studier på gnotobiotiska råttor att om vassla från immuniserade kor som injicerats med hela S. mutans-bakterier blandades i råttornas kost fick djuren en minskad kariesutveckling (22). Man har också visat att råmjölk från kor som immuniserats med både S. mutans och S. sobrinus kan hämma upptaget av glukos samt bildandet av både glukan och fruktan hos S. mutans (23). I försök på människa kunde man visa att hos individer som sköljde munnen med vasslan blockerade antikropparna bindningen av S. mutans till experimentella salivpellicklar. Det stödde också humana leukocyters förmåga att ta upp och oskadliggöra främmande kroppar (fagocytos) (24) (till exempel ta död på S. mutans) samt minskade antalet S. mutans (25). I en nyligen publiserad artikel kunde man få fram bovina antikroppar som riktades mot ett syntetiskt protein som bestod av den salivbindande delen i PAc (SAI/II) och den glukanbindande delen i Gtf-I. Råttor som fick samma immunprodukt via födan visade en minskad kariesutveckling (26). Att kombinera två viktiga virulensfaktorer är ett intressant sätt att öka slagkraften hos ett vaccin.

Forskningen visar att bovina antikroppar eller råmjölksprodukter kan användas för passiv immunisering av människa eftersom de flesta individer tål mjölk. Redan nu säljs råmjölksprodukter från icke immuniserade djur i dagligvaruhandeln till exempel nyligen i tandkräm. Produkterna påstås skydda mot infektioner, men innehåller inga riktade antikroppar.

Antikroppar från ägg

Överföringen av immunitet från höna till kyckling via ägget beskrevs redan för mer än ett sekel sedan (27). Transporten av passiv immunitet mellan höna och kyckling sker via ett membran till gulan under äggets mognad (28). Exakt hur processen fungerar är fortfarande inte klarlagt. De immunoglobuliner eller antikroppar som utvinns från äggulan benämns IgY (29). Hos kor blir ökningen av antikroppshalterna efter immunisering ganska blygsam medan hönor kan hyperimmuniseras (30). Koncentrationen av IgY i äggula kan uppgå till 25 mg/ml. Under ett år kan en enda höna ge upp till 40 gram IgY. Detta gör naturligtvis äggantikroppar attraktiva för passiv immunisering. Kycklingantikroppar eller äggantikroppar har dock visat sig vara mindre stabila i miljöer med lågt pH (som till exempel i magsäcken). De är också mer känsliga för spjälkning av pepsin (28).

Antikroppar från ägg har använts vid passiv immunisering mot S. mutans och karies. Kariesutvecklingen minskade hos råttor som fick immunoglobuliner från hönor som immuniserats med hela celler av S. mutans (31). Försök har även gjorts på människa. Hos individer som fick skölja runt antikroppar i munnen minskade mängden S. mutans i saliv och plack i relation till den totala mängden streptokocker (28). Försök har också gjorts med kycklingantikroppar som riktades mot cellbundet Gtf. När man administrerade IgY via födan minskad kariestillväxten (1). Muntorra försöksdjur som gavs anti Gtf-antikroppar via dricksvattnet hade mindre mängd glattytekaries och fissurkaries jämfört med en kontrollgrupp (32). Resultatet visar att äggantikroppar kan fungera i en muntorr miljö och skulle vara en möjlig behandlingsstrategi för patienter med hög kariesaktivitet. Det har även framställts antikroppar mot ytterligare ett antigen hos S. mutans; glukanbindande protein, GBP. När dessa antikroppar gavs till råttor via födan kunde man se en minskad kariesutveckling i molarer under kort tid (33).

Trots att stabiliteten hos IgY är lägre jämfört med humana och bovina antikroppar har de en potential som passiv immunisering mot karies tack vare tillgängligheten (ägg är en vanlig föda världen över) och dess höga koncentration av antikroppar. Trots det är passiv immunisering med äggantikroppar mot karies i dag en relativ dyr behandling. Att kunna öka «skörden» av antikroppar från varje ägg skulle göra dem attraktivare ur ekonomisk synvinkel.

Monoklonala antikroppar

När det gäller monoklonala antikroppar mot S. mutans och karies finns omfattande forskning på både djur och människa. Monoklonala antikroppar har en ökad vidhäftningsförmåga och en högre specificitet än polyklonala antikroppar. Framställningen är exklusiv och kostsam och sker i cellkulturer. Denna typ av antikroppar används mest i laboratorieexperiment där det endast behövs en mycket liten mängd. I några uppmärksammade kariesstudier har dock lokal applicering av monoklonala anti-AgI/II-antikroppar hos Rhesusapor minskat mängden S. mutans på glatta ytor och i fissurer. Resultatet blev lägre kariesutveckling upp till ett år efter immuniseringen (34). Andra studier har visat att monoklonala antikroppar som riktas mot antigen B (SAI/II) hindrat inplantation av S. sobrinus hos råtta (35). I humanstudier applicerade Ma et al. monoklonala antikroppar mot AgI/II direkt på tänder och lyckades förhindrade kolonisation av S. mutans (36). 1995 lyckades man klona och uttrycka en monoklonal antikropp från mus riktad mot SAI/II i tobaksplantor (Nicotina tabacum) (37). Denna antikropp var unik eftersom den byggts upp av delar från en musantikropp men med en sekretorisk del från kanin. De olika delarna sattes in i separata tobaksplantor. Därefter korsades plantorna och resultatet blev en sekretorisk växtantikropp. Tack vare den sekretoriska delen kunde växtantikroppen överleva 3 dagar jämfört med 1 dag för en IgG-antikropp (38). Växtantikroppen skyddade individer från rekolonisation av S. mutans under minst 4 månader sedan den tillförts lokalt (38). Det krävs dock stora mängder tobaksplantor för att utvinna antikroppar i den mängd som krävs för passiv immunisering mot karies. Men det är hisnande att föreställa sig att man i framtiden skulle kunna odla antikroppar i växter.

Hos lamadjur, dromedarer och kameler finns en unik uppsättning antikroppar. Dessa antikroppar är motståndskraftigare mot värme och har lågt pH (39). Den föränderliga delen av en sådan antikropp kallas VHH och är den minsta naturligt förekommande molekylen med antigenbindande egenskaper (40). VHH-fragment är lätta att klona och kan uttryckas i både bakterier och svampar (41). De kännetecknas av både hög specificitet och affinitet (42). I en nyligen genomförd studie utvecklades ett rekombinerat fusionsprotein från lama VHH-fragment som riktades mot S. mutans som sammanklumpats med Glucosoxidas (GOx). Detta VHH-GOx-protein kunde känna igen och binda S. mutans och även i låga koncentrationer oskadliggöra bakterien (43). GOx är ett enzym som ansvarar för produktionen av väteperoxid i närvaro av glukos och syre. Enzymet anses även kunna ha en bakteriedödande effekt (44). Generellt sett krävs det en bivalent struktur för att antikroppar ska klumpa samman bakterier och utverka sin effekt. Tidigare studier har visat att VHH inte kan verka som enskilda fragment eftersom den antigenbindande variabla delen inte ensamt klarar av att klumpa samman bakterier. Därmed förloras en viktig egenskap som gör VHH-fragment mer ineffektiva (45). Lokal applisering av VHH (eller VHH-GOx) gav överraskande nog en minskad utveckling av glattytekaries hos muntorra råttor. Vi kunde dock inte i våra studier visa att glukosoxidasenzymet har tilläggseffekt (46). De stora fördelarna med antikroppsfragment från lama är deras stabilitet och storlek vilket gör dem höggradigt intressanta för framtida forskning och användning.

Laktobaciller som bärare av vaccin mot karies

Laktobaciller har i tidigare studier uttryckt immunstimulerande effekter på både slemhinnans och det systemiska immunsystemet (47). Laktobaciller är enkla att odla och ger höga koncentrationer till låg kostnad. Det har också varit möjligt att via genetisk omvandling uttrycka bitar av antigen på ytan av laktobaciller och på så sätt aktivera immunssytemet (48).

En vektor är en plasmid som innehåller genetisk information samt olika signaler som påverkar bakteriecellen så att den startar avläsning, produktion och exempelvis transport av ett visst protein till ytan. Plasmiden innehåller oftast någon form av markör för antibiotikaresistens för att möjliggöra selektiv odling av de omvandlade bakterierna. Om denna markör saknas kommer bakterien att göra sig av med sin «börda» (det «tillfogade» genetiska fragmentet) och produktionen av proteinet avbryts. Att vända på begreppet och istället uttrycka en antikropp på ytan av laktobacillen är inte möjligt på grund av antikroppmolekylens storlek. En vektor har nämligen ett mycket begränsat «utrymme» och kan bara uttrycka små proteiner. Den klassiska antikroppen är en bivalent struktur som består av tunga och lätta kedjan med den antigenbindande variabla delen, Fab, och den konstanta Fc-delen som fungerar som en signalflagga för andra aktörer i immunsystemet. Ett så kallat single chain fragment (scFv) består av enbart den antigenbindande delen av den lätta och tunga kedjan, sammanhållna av en så kallad linker. De skapas inte i naturen utan med molekylärbiologiska metoder. Vi har lyckats skapa genen för ett single chain fragment som är riktat mot SAI/II hos S. mutans och fått den att uttryckas på ytan av Lactobacillus parpacasei. Den ursprungliga antikroppen är den monoklonala musantikropp som tidigare testats i både djurstudier och humanstudier (49). De transformerade laktobaciller som har scFv på ytan sammanklumpade S. mutans (Fig. 2) och när dessa laktobaciller gavs till muntorra råttor via dricksvattnet ledde det till en minskad utveckling av glattytekaries (6).

Dessa resultat är unika på flera sätt. För första gången var det möjligt att uttrycka funktionella antikroppsfragment på ytan av mjölksyraproducerande laktobaciller. De förändrade laktobacillerna ska kunna kolonisera munhålan tillfälligt och direkt på plats producera antikroppsfragment mot S. mutans och på så sätt förhindra karies. Det fortsatta arbetet med dessa så kallade transformanter har bland annat handlat om att byta ut och förbättra vissa delar av vektorerna. I en andra serie av expressionsvektorer ändrades den så kallade promotorn så att den gav ett konstant uttryck av scFv (till skillnad mot de första vektorerna som «kickades igång» av mannitol). Vi fann att även de nya transformanterna kunde uttrycka funktionella antikroppsfragment på ytan av L. paracasei. När de gavs till muntorra råttor minskade mängden karies. Kariesutvecklingen var också något lägre i jämfört med de laktobaciller som framställts tidigare (17). Hypotesen har varit att single chain-antikropparna känner igen, binder och blockerar SAI/II och förhindrar på så sätt vidhäftning av S. mutans till tandytan.

Tack vare resultaten från experimentella modeller öppnas nya möjligheter. Våra laktobaciller har en väl utvecklad förmåga att sammanklumpa S. mutans och med ett antal scFv på cellytan kan det kanske få egenskaper som liknar bivalenta eller multivalenta antikroppar. Antikroppsfragmentet skulle också teoretiskt kunna fungera som en målsökare och binda laktobacillen till S. mutans. Därefter skulle produktionen av hämmande substanser oskadliggöra S. mutans. Detta är dock endast spekulationer. Mycket arbete återstår med att kartlägga mekanismen och vidareutveckla systemet.

I dag är det plasmidburna systemet för osäkert och innehåller resistensgener för antibiotika. Det gör att det inte lämpar sig för studier på människa. Nya metoder håller dock på att utvecklas. Det är fullt möjligt att välja ut en human stam av laktobaciller som har en låg produktion av mjölksyra som därmed kan utnyttjas för att förhindra progression av kariesutvecklingen. Kostnaden för ett sådant vaccin borde kunna bli lågt vilket ökar möjligheten för att en sådan behandling ska kunna nå ut till patienterna. Det ska dock nämnas att i dagsläget tycks acceptansen för genmanipulerade mikroorganismer vara låg hos befolkningen.

Slutsats och framtida aspekter

Passiv immunisering har i tidigare studier visat sig vara en framgångsrik metod för att behandla och förebygga karies. Fördelarna med passiv immunisering är flera: Det är en snabb, lokal och säker metod med små risker för bieffekter. Det sker ingen aktivering av immunsystemet vilket eliminerar risken för korsreagerande antikroppar. Endast ett fåtal studier har dock utförts på människa och effekter av metoden har enbart påvisats på bakteriell nivå och inte på kariesutvecklingen. Det krävs med andra ord mer forskning på området.

Karies orsakas av S. mutans men är en multifaktoriell sjukdom. Behandling och profylax mot kariessjukdom ska riktas mot samtliga faktorer där passiv immunisering utgör en möjlig väg gärna i kombination med traditionell terapi och profylax. Det ska ses som en riktad behandling mot kariesframkallande mutansstreptokocker. Patienter som lider av muntorrhet har en mer kariesrelaterad mikroflora (50) och strålningsbehandlade patienter utvecklar snabbt karies (51). Passiv immunisering i form av ett munsköljningspreparat skulle vara ett bra alternativ för muntorra patienter med skör munslemhinna. Med den kunskap vi har i dag skulle det troligen krävas ett flertal behandlingsperioder per år för en kariesaktiv patient. Själva behandlingen skulle dock kunna skötas av patienten själv i hemmet (i form av munsköljning eller sugtabletter).

Karies är ingen livshotande sjukdom och kostnaden för att utveckla ett vaccin mot karies måste sättas i proportion till det. Att framställa antikroppsbestyckade mjölksyraproducerande laktobaciller kan vara en framtida väg. Ännu återstår dock mycket arbete för att anpassa systemet för patientstudier. Morgondagens transformerade laktobaciller är redan på väg. Parallellt måste mekanismen hos de förändrade laktobacillerna kartläggas. Sökandet efter en optimal laktobacillkandidat för munhålan har redan inletts. Passiv immunisering som metod för att förebygga sjukdom kan också användas vid andra sjukdomar i munhålan som orsakas av mikroorganismer (till exempel infektion av Candida albicans och Porphyromonas gingivalis).